Produzzjoni u karatterizzazzjoni bijokimika tal-lakkase tal-faqqiegħ oyster NRC 620 u evalwazzjoni tal-effiċjenza tagħha fiċ-ċjarifika tal-meraq tat-tuffieħ.

Wara 25 jum ta' inkubazzjoni statika f'28°C, il-lakkażi minn *Pleurotus ostreatus* NRC620 uriet l-ogħla attività fil-mezz tal-kultura fungali. Il-valuri ottimali tal-pH u t-temperatura għal din l-enzima kienu 3.0 u 70°C, rispettivament. Wara sagħtejn ta' inkubazzjoni f'40°C u 50°C, l-attività tal-enzima żammet 68.33% u 59.61%, rispettivament. Wara sagħtejn ta' inkubazzjoni f'buffer taċ-ċitrat-fosfat (pH 7.0), l-attività tal-enzima baqgħet 100%. Iż-żieda ta' 10 mM MgSO₄ u CuSO₄ żiedet l-attività tal-enzima b'madwar 21% u 35%, rispettivament, filwaqt li NaCl, MnCl₂, KCl, u CaCl₂ inibixxu l-attività tal-enzima. Bl-użu tal-ABTS bħala sottostrat, il-parametri kinetiċi (Km u Vmax) tal-lakkażi *Pleurotus ostreatus* NRC 620 kienu 1.99 mM u 16,217 μmol min−1 L−1, rispettivament. It-trattament enżimatiku tal-kampjuni tal-meraq tat-tuffieħ naqqas b'mod sinifikanti kemm il-pH kif ukoll il-viskożità, u dan it-tnaqqis kien korrelat ma' żieda fil-ħin tal-ħażna. It-trattament bil-lakkażi rriżulta fi tnaqqis żgħir fil-kontenut fenoliku totali tal-meraq tat-tuffieħ, iżda ma ġie osservat l-ebda tnaqqis fl-attività antiossidanti.
Fi snin reċenti, ir-riċerkaturi ffokaw fuq l-applikazzjoni tal-bijoteknoloġija ekoloġika fl-industrija tal-ikel. Il-lakkażi hija waħda mill-aktar enzimi utli fl-industrija tal-ikel, u ssib applikazzjonijiet f'oqsma bħall-ipproċessar tal-meraq, il-ħami, l-istabbilizzazzjoni tal-inbid, u t-titjib tal-kwalitajiet organolettiċi tal-prodotti tal-ikel.¹Ħafna pjanti ogħla u mikro-organiżmi jnixxu l-lakkażi,²u fungi bħal deuteromycetes, askomiċeti, u basidiomycetes jistgħu wkoll jipproduċu lakkażi.³Lakkażi (EC 1.10.3.2) hija ossidasi blu li tnaqqas l-ossiġnu molekulari għall-ilma billi tuża sistema li tikkonsisti fi tliet atomi tar-ram differenti, u b'hekk tossidizza diversi komposti fenoliċi u amini aromatiċi. Matul il-produzzjoni ta' meraq tal-frott u l-ħaxix, it-tidwir enżimatiku u mhux enżimatiku huma kwistjonijiet kritiċi.⁴Peress li dawn is-sustanzi jaffettwaw b'mod negattiv il-kulur, it-togħma u l-aroma tal-meraq, iridu jitneħħew.⁵
Mill-frott kollu, it-tuffieħ huwa l-aktar ikkunsmat madwar id-dinja u fl-Unjoni Ewropea. Fl-2019, il-produzzjoni tat-tuffieħ kienet it-tielet globalment, u qabżet it-87 miljun tunnellata.⁶It-tuffieħ fihom bosta komposti fenoliċi, inklużi flavonoids u aċidi fenoliċi bħall-aċidu kaffeiku u l-aċidu kloroġeniku.⁷Minħabba li l-meraq tat-tuffieħ tipikament jiġi kkunsmat fil-forma ċara tiegħu, madwar 50% sa 90% tal-komponenti fenoliċi jintilfu matul il-proċess ta' filtrazzjoni.⁸Illum il-ġurnata, il-konsumaturi għandhom it-tendenza li jagħżlu prodotti pproċessati minimament, bħal meraq tat-tuffieħ imdardar b'kontenut għoli ta' polifenoli. Madankollu, minħabba l-kontenut fenoliku għoli tiegħu, dan it-tip ta' meraq tat-tuffieħ huwa partikolarment suxxettibbli għat-tibdil fil-kulur u l-iskurament.⁹Diversi teknoloġiji, inklużi metodi ta' trattament bis-sħana bħall-pasturizzazzjoni f'60–90°C, jintużaw biex inaqqsu jew jipprevjenu li l-meraq tat-tuffieħ jiskura.¹⁰Madankollu, skond riċerka minn Sauceda-Gálvez¹¹, l-ipproċessar termali jista' jeqred kimiċi volatili u jaffettwa l-kwalitajiet organolettiċi tal-meraq tat-tuffieħ. Alternattivi għall-metodi ta' pproċessar termali jinkludu dijossidu tal-karbonju superkritiku, radjazzjoni ultravjola, ultrasound, pressjoni idrostatika għolja, jew omoġenizzazzjoni bi pressjoni għolja.¹²L-effiċjenza ta’ dawn it-teknoloġiji u r-rendiment ta’ meraq tal-frott adattat jiddependu fuq il-parametri użati u l-karatteristiċi tal-prodott. L-użu mifrux tagħhom huwa limitat minn spejjeż għoljin, effetti negattivi fuq il-kwalità ta’ xi prodotti tal-ikel, jew inattivazzjoni inadegwata tal-enzimi.^13,14
Il-lakkażi tista' tintuża biex tistabbilizza u tiċċara l-meraq tal-frott.¹⁵Gökmen et al.¹⁶Jirrakkomanda l-użu tal-lakkase għall-kjarifika tal-meraq tal-frott għaliex tneħħi b'mod effettiv il-komposti fenoliċi billi tikkonvertihom f'polimeri jew oligomeri li jitneħħew faċilment minn kwalunkwe membrana ta' ultrafiltrazzjoni, u b'hekk il-meraq tat-tuffieħ iżomm kulur u ċarezza stabbli sa sitt ġimgħat f'50°C. Il-lakkase purifikata tat-*Trichoderma* ġiet immobilizzata fuq żibeġ tal-alumina u ntużat biex tneħħi b'mod selettiv il-komposti b'togħma mhux mixtieqa kkawżati minn kontaminazzjoni mikrobjali tal-meraq tat-tuffieħ.¹⁷
Madwar 80-90% tal-komponenti volatili tal-meraq tat-tuffieħ huma esteri u aldeidi, li jagħtu aroma unika lill-meraq.¹⁸Il-lakkaż minn *Trametes versicolor* ġie immobilizzat fuq appoġġ irħis magħmul minn fibra naturali minn qxur żgħar tal-ġewż tal-Indi għall-kjarifika tal-meraq tat-tuffieħ.¹⁹Studji preċedenti investigaw l-istabbilizzazzjoni tal-meraq tat-tuffieħ (kulur u turbidità) bl-użu ta' metodi mingħajr enzimi jew ta' immobilizzazzjoni, jew flimkien ma' ultrafiltrazzjoni.^5,19Madankollu, l-effett tal-lakkasi fungali fuq il-proprjetajiet fiżikokimiċi tal-meraq tat-tuffieħ waqt il-ħażna għadu mhux ċar. Għalhekk, l-għan ta’ dan l-istudju kien li jinvestiga b’mod sperimentali l-bidliet fil-proprjetajiet fiżikokimiċi, il-kontenut tal-kompost fenoliku, u l-attività antiossidanti tal-meraq tat-tuffieħ wara trattament b’lakkasi fungali u ħażna fil-friġġ ta’ ġimagħtejn. Il-lakkasi għandhom il-ħila li jossidizzaw il-komposti fenoliċi, li jagħmilhom promettenti għall-użu f’diversi proċessi industrijali, inkluża l-kjarifika tal-meraq. Dan l-istudju eżamina l-lakkasi minn *Pleurotus ostreatus* NRC 620, b’fokus fuq il-kundizzjonijiet ideali għall-attività u l-effettività tagħhom fil-kjarifika tal-meraq. Filwaqt li r-riċerka fuq il-faqqiegħ oyster (P. ostreatus NRC 620) għadha limitata, studji preċedenti eżaminaw enzimi minn diversi sorsi fungali, bħal Trametes versicolor u Ganoderma lucidum. L-għan ta’ dan l-istudju kien li jevalwa l-applikazzjoni potenzjali ta’ dan l-enzima fl-industrija tal-ikel u jenfasizza l-proprjetajiet uniċi tiegħu, partikolarment il-pH u t-temperatura ideali tiegħu.
2,2′-Azooxybis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) (ABTS) inxtara minn Sigma-Aldrich (il-Kanada). Ir-reaġenti l-oħra kollha kienu ta' grad analitiku.
Iċ-Ċentru tal-Ġbir tal-Kultura Mikrobjali taċ-Ċentru Nazzjonali tar-Riċerka kiseb ir-razza magħrufa tal-faqqiegħ oyster NRC620. Wara s-subkultura, din ir-razza nħażnet fuq slants tal-agar tad-destrosju tal-patata f'4°C. Il-metodu ta' preparazzjoni tal-inokulu kien kif ġej: miċelju żviluppat kompletament ta' 10 ijiem ġie inokulat fuq pjanċi tal-agar tad-destrosju tal-patata u inkubat f'28°C. Wara 10 ijiem, tliet blokki miċeljali b'dijametru ta' 12 mm tneħħew mill-mezz tal-agar bl-użu ta' punch tal-metall sterili u tqiegħdu fi fliexken Erlenmeyer ta' 250 mL b'tappijiet tal-qoton li fihom 50 mL ta' mezz ta' kultura sterilizzat (pH 5.0, kif deskritt qabel minn Othman et al.²⁰). Il-kulturi ġew inkubati f'temperatura ta' 28°C għal 18-il jum. Il-kulturi mbagħad ġew iffiltrati minn karta tal-filtru Whatman Nru 1, u s-supernatant li rriżulta serva bħala s-sors tal-enzima.
L-attività tal-lakkażi ġiet determinata bl-użu ta' ABTS bħala sottostrat. It-taħlita ta' reazzjoni (2 mL) kien fiha 500 μL ta' 0.3 mM ABTS (maħlul f'0.1 M buffer tas-sodium citrate, pH 4.5) u l-ammont meħtieġ ta' kampjun tal-enzima dilwit b'ilma distillat.^21,22Meta wieħed iqis li l-lakkażi tista' tossida l-ABTS f'temperatura tal-kamra (28 °C ± 2), l-ossidazzjoni tal-ABTS ġiet determinata billi tkejlet iż-żieda fl-assorbenza f'420 nm (ε₄₂₀= 36,000 ċm^-1 M ^-1) bl-użu ta' spettrofotometru UV Agilent Carry-100. Kienet meħtieġa unità waħda ta' attività ta' lakkażi biex tossida 1 μmol ABTS kull minuta. Il-konċentrazzjoni tal-proteina ġiet determinata bil-metodu Bradford bl-użu ta' albumina tas-serum bovin bħala kontroll intern.^23,24
Wara li nkiseb l-enżima mir-razza tal-faqqiegħ oyster NRC 620, l-attività tagħha tkejlet f'intervalli differenti ta' kultivazzjoni għal 25 jum taħt kundizzjonijiet statiċi f'28 °C.
Biex jiġi studjat l-effett tat-temperatura fuq l-attività tal-lakkażi, twettqu esperimenti fil-medda ta' temperatura minn 20 sa 90 °C. Qabel ma żdiedet l-enżima u bdiet ir-reazzjoni, il-buffer (0.1 M sodium citrate, pH 4.5) u s-sottostrat (ABTS) tħalltu u ġew inkubati għal 5 minuti f'temperaturi varji. L-istabbiltà termali tal-enżima ġiet ivvalutata permezz ta' inkubazzjoni f'0.05 M sodium phosphate buffer (pH 7.0) f'40, 50, 60, u 70 °C għal sagħtejn, rispettivament. L-attività residwa mbagħad ġiet ivvalutata bl-użu tas-sottostrat ABTS.
L-effett tal-pH fuq l-attività tal-lakkażi ġie vvalutat bl-użu tal-ABTS bħala sottostrat f'buffers taċ-ċitrat-fosfat 0.1 M b'firxa ta' pH ta' 2.5 sa 7.0. Is-soluzzjoni tal-enżima ġiet inkubata f'40°C għal sagħtejn f'buffers taċ-ċitrat u Tris 0.1 M (pH 3, 4, 6, u 7) biex tiġi vvalutata l-istabbiltà tal-pH. L-attività residwa bl-ABTS bħala sottostrat ġiet ikkalkulata wara l-inkubazzjoni.
Il-lakkażi ġiet inkubata għal 10 minuti f'buffer tas-sodium phosphate (0.05 M, pH 7.0) li kien fih diversi joni tal-metall (Mg2+, Cu2+, Co2+, Ca2+, Zn2+, K+, Na+, u Mn2+) f'konċentrazzjonijiet ta' 2.5 mM u 10 mM, rispettivament. Is-sottostrat (ABTS) imbagħad ġie miżjud biex tinbeda r-reazzjoni, u l-attività relattiva ġiet ivvalutata.
L-ossidazzjoni tal-ABTS bil-lakkażi f'konċentrazzjonijiet varji (0.025–3 mM) ġiet imkejla f'pH 4.5 biex jiġu ddeterminati l-parametri kinetiċi (Vmax u Km). Il-parametri kintiċi^kostantital-ekwazzjoni ta' Michaelis-Menten ġew ikkalkulati bl-użu ta' plott Lineweaver-Burk, li jipplotta r-reċiproku tar-rata tar-reazzjoni bħala funzjoni tal-konċentrazzjoni tas-sottostrat. Il-kostanti kinetiċi ġew ikkalkulati mill-plott Lineweaver-Burk bl-użu tas-softwer GraphPad Prism verżjoni 6.01.
Wara li t-tuffieħ inħasel sewwa bl-ilma tal-vit, inqatgħu min-nofs u ġew mgħaffġin bl-użu ta' meraq tat-tuffieħ Braun MP80 kompletament awtomatiku (magħmul fil-Ġermanja). Il-meraq ġie ffiltrat minn erba' saffi ta' drapp tal-ġobon. Ma żdiedu l-ebda enzimi mal-grupp ta' kontroll, filwaqt li 2.0% lakkażi (l-aktar konċentrazzjoni effettiva ttestjata) ġiet miżjuda mal-meraq tat-tuffieħ ippreparat frisk, li mbagħad inħażen f'4°C għal ġimagħtejn.
L-aċidità titrabbli (TA) u l-pH ġew determinati skont il-metodu ta' Boulton et^al.27Il-pH ta' kull kampjun tkejjel bl-użu ta' miter tal-pH diġitali (JENWAY 3510 pH meter). L-aċidità titrabbli (TA) ġiet ikkalkulata abbażi tal-aċidu maliku bl-użu tal-formula li ġejja.
Fejn V u C huma l-volum (mL) u l-konċentrazzjoni (0.1 mol/L) tas-soluzzjoni tal-idrossidu tas-sodju użata fit-titrazzjoni, rispettivament. K huwa l-koeffiċjent tal-konverżjoni tal-aċidu maliku, ugwali għal 0.067, u W hija l-massa (g) tal-meraq tat-tuffieħ.
Is-solidi totali solubbli (^TDS) tal-kampjuni kollha tal-meraq ġie determinat bl-użu ta' rifrattometru tal-but PAL-1 (ATAGO, Tokyo, il-Ġappun). Wara kull kejl, il-lenti ottika tlaħlaħ b'ilma dejonizzat, u kull kampjun tal-meraq tat-tuffieħ ġie ttestjat tliet darbiet. Il-valur għal kull kampjun ġie kkalkulat billi ttieħdet il-medja tat-tliet kejl. Il-medja ± id-devjazzjoni standard għal kull kampjun tal-meraq tat-tuffieħ ġiet ikkalkulata wkoll billi ttieħdet il-medja ta' dawn ir-riżultati.
Il-viskoelastiċità tal-kampjuni tal-meraq tat-tuffieħ ġiet ivvalutata bl-użu ta' viskometru rotazzjonali (RV, Rheotest 2, il-Ġermanja). Il-kampjun tqiegħed ġewwa ċ-ċilindru "S2" tal-viskometru. Il-viskożità apparenti kienet rappreżentata mill-inklinazzjoni tal-kurva tal-istress shear kontra r-rata shear, li ġiet ikkalkulata mill-istress shear u l-kurvi korrispondenti f'diversi rati shear (minn 1.00 sa 437.4 s⁻¹). Il-formula għall-kalkolu tal-viskożità apparenti hija kif ġej:
Fejn η hija l-viskożità apparenti (cP), τ hija l-istress shear (dyn/cm²), γ hija r-rata shear (sec⁻¹), u (τ) hija kkalkulata bl-użu tal-valuri tat-torque (α) u taċ-ċilindru (Z) bl-użu tal-formula li ġejja: τ = Z . α.
L-indiċi tal-browning ġie determinat skont il-metodu ta' Meidav ​​​​et^al.29Kampjun ta' meraq ta' 10 ml ġie ċċentrifugat b'2750 xg għal 10 minuti. 5 ml tas-supernatant tal-meraq tħalltu ma' 5 ml ta' etanol ta' 95%. L-assorbenza tat-taħlita tkejlet f'420 nm bl-użu ta' spettrofotometru Shimadzu UV (UV-1601 PC).
Il-kontenut fenoliku totali (TPC) ġie determinat kolorimetrikament bl-użu tar-reaġent Folin-Ciocalteu kif deskritt minn Boulton et al.^[27]]. Kurva standard tal-aċidu galliku ġiet mibnija għal konċentrazzjonijiet minn 0 sa 500 mg/L (^r²= 0.997). Ir-riżultati huma espressi bħala ekwivalenti ta' aċidu galliku (mg GAE/mL).
Żid 125 μL ta' ilma distillat u 2850 μL ta' soluzzjoni FRAP ma' 25 μL ta' meraq tat-tuffieħ u ħalli t-taħlita fid-dlam għal³⁰min. Imbagħad kejjel l-assorbenza f'593 nm bl-użu ta' spettrofotometru UV Shimadzu (UV-1601 PC). Ir-reaġent FRAP ġie ppreparat billi tħalltu 300 mM buffer tal-aċetat (pH 3.6), 20 mM klorur tal-ħadid(III), u 10 mM 2,4,6-tris(2-pyridyl)triazine (TPTZ) (maħlul f'40 mM HCl) fi proporzjon ta' 10:1:1. Kurva standard ġiet iġġenerata bl-użu ta' Trolox bħala l-istandard (^R²= 0.999), u r-riżultati huma espressi bħala μM Trolox/mL.
L-attività antiossidanti tal-meraq ittrattat u mhux ittrattat ġiet determinata bl-użu tal-metodu DPPH biex tiġi evalwata l-abbiltà tagħhom li jeliminaw ir-radikali ħielsa tad-DPPH.³¹Għaxar mikrolitri ta’ meraq tħalltu ma’ 1 ml ta’ soluzzjoni DPPH (100 μM) fil-metanol. Wara reazzjoni fid-dlam għal 30 minuta, l-assorbenza tat-taħlita tkejlet f’517 nm bl-użu ta’ spettrofotometru Shimadzu UV (UV-1601 PC). Ir-riżultati ġew espressi bħala ekwivalenti ta’ trolox (μM trolox/ml) ibbażati fuq kurva ta’ kalibrazzjoni (_^R2= 0.990).
Id-dejta miksuba wriet li l-produzzjoni massima ta' lakkasi ġiet osservata fil-faqqiegħ oyster NRC 620 sa tmiem it-18-il jum tal-fermentazzjoni, u laħqet attività ta' 1302 U/L. Dan serva bħala l-bażi għad-determinazzjoni tal-ħin ottimali ta' kultivazzjoni għall-produzzjoni ta' lakkasi (Figura 1). Għalkemm il-produzzjoni tal-enzimi żdiedet biż-żieda fil-ħin tal-kultivazzjoni, ir-rata taż-żieda ma kinitx direttament proporzjonali għall-ħin tal-kultivazzjoni; wara 21 jum, l-attività tal-enzimi żdiedet biss b'90 U/L (għal 1390 U/L). Għalhekk, fl-aħħar mill-aħħar intgħażel 18-il jum bħala l-ħin ottimali ta' kultivazzjoni biex jiġi bbilanċjat ir-rendiment tal-prodott mal-benefiċċji ekonomiċi taż-żieda fil-ħin tal-kultivazzjoni.
Effett tal-ħin tal-kultivazzjoni fuq ir-rendiment tal-lakkażi f'Pleurotus ostreatus NRC 620. Tliet blokki miċeljali fungali (12 mm) ġew inokulati f'50 ml ta' mezz sterili u mbagħad ikkultivati ​​f'28 °C għal ħinijiet differenti.
Konsistenti ma' studji oħra, ir-riżultati tagħna jindikaw li l-perjodu ideali ta' kultura biex jinkiseb l-ogħla livell ta' sekrezzjoni ta' lakkase mill-fungi x'aktarx ikun bejn 7 u 36 jum.³²Skont Ezike et al.³³*Trametes polyzona* WRF03 ipproduċa l-ogħla ammont ta’ lakkażi sa tmiem id-disa’ jum tal-fermentazzjoni, b’attività speċifika ta’ 1637 U/mg proteina. Barra minn hekk, Othman et al.³⁴instab li *Trichoderma harzianum* S7113 segrega ammont kbir ta' lakkażi fil-ħames jum tal-kultura. Ir-rata ta' produzzjoni tal-lakkażi laħqet l-ogħla attività fl-erbatax-il jum u mbagħad naqset gradwalment.³⁴Għalkemm is-sekrezzjoni tal-enzimi tista' sseħħ ukoll matul il-fażi ewlenija tat-tkabbir, ġeneralment tilħaq il-quċċata tagħha matul il-fażi intermedja u tiġi attivata mill-konsum ta' sors ta' karbonju jew nitroġenu.^34,35
Għalkemm il-lakkażi minn Pleurotus ostreatus NRC 620 wriet attività għolja fuq firxa wiesgħa ta' temperaturi minn 50°C sa 80°C, u qrib l-ogħla attività (69–98%), l-attività massima tagħha ġiet osservata f'70°C (Fig. 2a). Barra minn din il-firxa ta' temperaturi, l-attività tal-enzima naqset f'madwar 70°C. Dawn ir-riżultati jissuġġerixxu li l-enzima hija attiva f'temperaturi għoljin, x'aktarx minħabba li temperatura għolja żżid l-enerġija kinetika tar-reazzjoni.
Effett tat-temperatura tar-reazzjoni (a) u l-pH (b) fuq l-attività tal-lakkażi f'*Pleurotus ostreatus* NRC 620. Temperaturi li jvarjaw minn 20 sa 90 °C intlaħqu billi t-taħlita ġiet inkubata minn qabel f'temperaturi differenti għal 5 minuti qabel ma żdiedet l-enzima u bdiet ir-reazzjoni. L-effett tal-pH fuq l-attività tal-lakkażi ġie vvalutat bl-użu ta' ABTS bħala sottostrat f'soluzzjonijiet li fihom 0.1 M buffer taċ-ċitrat-fosfat fuq firxa ta' pH ta' 2.5 sa 7.0.
Skont Ezike et^al.33, it-temperatura ottimali għal *Trametes polyzona* WRF03 laccase hija 55 °C, li hija l-istess bħal dik għal *Ganoderma lucidum*^lakkażi36u simili għat-temperatura ottimali (50 °C) għal *Trametes polyzona* KU-RNW02737^lakkażi . ^Baldrian38jinnota li, bħal fil-każ ta' sistemi oħra ta' enzimi li jiddegradaw il-lignin, il-medda ta' temperatura ideali għal-lakkażi hija bejn 50 u 70 °C.
Ir-riżultati wrew li l-enzima wriet l-ogħla attività f'pH 3.0, u laħqet 94% attività f'pH 3.5. Madankollu, baqgħet attiva fuq firxa wiesgħa ta' pH minn 2.5 sa 7.0 (Figura 2b). Barra minn hekk, wriet attività ogħla f'kundizzjonijiet aċidużi meta mqabbla ma' kundizzjonijiet newtrali jew alkalini. L-attività tagħha baqgħet mill-inqas 77% fuq il-firxa ta' pH minn 2.5 sa 4.5, iżda laħqet biss madwar 38% f'pH 7.0. Il-pH ottimali għal-lakkażi minn *Trametes polyzona* WRF03 kien 4.533, li huwa l-istess bħall-pH għal-lakkażi minn *Trametes polyzona* KU-RNW02737, *Trichoderma harzanium* 39, *Pleurotus* sp. 40, u *Trametes hirsuta* 41. Madankollu, skont l-istudju minn Chairin et al.⁴², il-pH ottimali għal-lakkażi minn *Polymorpha f. sp.* WR710-1 huwa 2.2, filwaqt li l-pH ottimali għal-lakkażi minn *Polymorpha f. sp.* IBL-04 huwa 5.043. Ir-rabta tal-anjoni tal-idrossidu (inibitur tal-lakkażi) mal-atomi tar-ram tal-lakkażi T2/T3 tista' tkun ir-raġuni għat-tnaqqis fl-attività tal-lakkażi taħt kundizzjonijiet ta' pH newtrali jew alkalini. Dan jista' jfixkel it-trasferiment intern tal-elettroni miċ-ċentru T1 għaċ-ċentru T2/T3, u b'hekk^limitazzjonil-attività tal-enzima23,44
Billi l-enżima ġiet inkubata f'temperaturi differenti, instab li kemm il-ħin tal-inkubazzjoni kif ukoll it-temperatura affettwaw l-istabbiltà tal-enżima. Ta' min jinnota li l-lakkażi minn *Trametes polyzona* NRC 620 wriet stabbiltà ogħla f'40℃ u 50℃, billi żammet 68.33% u 59.61% tal-attività inizjali tagħha, rispettivament, wara 120 minuta (Figura 3a). B'kuntrast, taħt l-istess kundizzjonijiet (40℃ u 50℃, 120 minuta), il-lakkażi minn *Trametes polyzona* WRF03 żammet 64.38% u 42.92% tal-attività tagħha, rispettivament.³³Għall-kuntrarju, iż-żieda fil-ħin u t-temperatura tal-inkubazzjoni naqqset l-istabbiltà tal-lakkażi *Trametes polyzona* NRC 620; Wara inkubazzjoni f'60℃ u 70℃ għal 60 minuta, l-attività tagħha naqset għal 39.24% u 1.72%, rispettivament (Figura 3a). Konsistenti mar-riżultati sperimentali, il-lakkażi minn *Trametes polyzona* WRF03 uriet stabbiltà ogħla f'40 u 50℃ matul il-proċess tat-trattament termali.³³Bl-istess mod, Lueangjaroenkit et al.^al.37u Chairin et^al.42irrapporta l-istabbiltà tal-lakkasi minn Trametes polyzona KURNW027 u Trametes polyzona WR710-1 f'50 °C għal siegħa, rispettivament. Bħala bijokatalist utli applikabbli f'diversi oqsma bijoteknoloġiċi, il-lakkasi għandu jkollha stabbiltà u prestazzjoni tajba fuq firxa wiesgħa ta' temperaturi.
L-istabbiltà termostatika (a) u l-istabbiltà tal-pH (b) tal-lakkażi minn *Pleurotus ostreatus* NRC 620. L-istabbiltà termostatika ġiet ivvalutata billi s-soluzzjoni tal-enżima ġiet inkubata f'0.05 M buffer tas-sodju fosfat (pH 7.0) f'40, 50, 60, u 70 °C għal sagħtejn, rispettivament. L-istabbiltà tal-pH ġiet ivvalutata billi s-soluzzjoni tal-enżima ġiet inkubata f'0.1 M buffer taċ-ċitrat u buffer Tris (pH 3, 4, 6, u 7) f'40 °C għal sagħtejn. L-attività residwa ġiet ikkalkulata bl-użu tal-ABTS bħala sottostrat wara l-inkubazzjoni.
Biex niddeterminaw il-kundizzjonijiet ottimali għall-użu u l-ħażna tal-enzimi, investigajna l-effett tal-pH fuq l-istabbiltà tal-lakkażi. L-espożizzjoni għal valuri differenti ta' pH affettwat b'mod sinifikanti l-istabbiltà tal-istruttura tal-proteina, u b'hekk influwenzat l-istabbiltà u l-attività tal-molekula tal-enzima. Ir-riżultati wrew li l-enzima kienet inqas stabbli taħt kundizzjonijiet aċidużi, filwaqt li wriet stabbiltà aħjar f'valuri ta' pH ogħla (reġjuni newtrali u alkalini). F'valuri ta' pH ta' 7.0, 6.0, 4.0, u 3.0, ir-rati ta' żamma tal-enzima wara 120 minuta kienu ta' madwar 100%, 62.54%, 52.39%, u 11.14%, rispettivament (Fig. 3b). Il-lakkażi *Strombus multisus* WRF03 wriet stabbiltà ogħla f'valuri ta' pH newtrali (5.5–6.5) u stabbiltà aktar baxxa f'valuri ta' pH aċidużi (taħt 4.0). Wara 120 minuta f'valuri ta' pH ta' 5.5, 6.0, u 6.5, ir-rati ta' żamma tal-enzimi kienu ta' madwar 82%, 100%, u 93%, rispettivament.³³Khairin et al.⁴²innota li l-lakkażi minn Trametes polyzona WR710-1 kienet stabbli fil-medda ta' pH ta' 6.0 sa 7.0, filwaqt li Sayed et al.⁴⁵wera li l-lakkażi kienet aktar stabbli taħt kundizzjonijiet ta' pH newtrali. Madankollu, il-lakkażi minn Cerrena unicolor wriet ukoll stabbiltà taħt kundizzjonijiet alkalini (pH 9.0)⁴⁶Il-lakkasi studjati wrew stabbiltà għolja fuq firxa wiesgħa ta' pH. Din tista' tkun karatteristika importanti għal applikazzjonijiet industrijali.
Peress li xi joni tal-metall għandhom kemm effetti stimulanti kif ukoll inibitorji fuq l-attività tal-enzimi, l-effetti tagħhom fuq l-attività tal-enzimi għandhom jiġu kkunsidrati f'applikazzjonijiet industrijali. Dan huwa kruċjali għaliex il-joni tal-metall huma kontaminanti ambjentali komuni li jistgħu jaffettwaw l-istabbiltà u s-sintesi tal-enzimi extraċellulari.⁴⁷Biex ninvestigaw l-effetti ta' diversi joni tal-metall fuq il-lakkażi minn *Pleurotus ostreatus* NRC 620, wettaqna esperimenti korrispondenti. Kif muri fil-Figura 4, skont it-tip ta' metall użat, iż-żieda fil-konċentrazzjoni tal-joni tal-metall minn 2.5 mM għal 10 mM affettwat b'mod negattiv il-funzjoni tal-enzima. Pereżempju,^Mg²⁺ , ^Ko²⁺ , ^Żn²⁺, u^Cu²⁺jista' jistimula u jattiva l-attività tal-enzima, filwaqt li^Na⁺ , ^Mn²⁺ , ^Ca²⁺, u^K⁺jista' jinibixxi l-attività tal-enzima. F'konċentrazzjoni ta' 10 mM, il-joni Cu²⁺ u Mg²⁺ kienu l-aktar attivaturi potenti tal-attività tal-lakkażi minn *Pleurotus ostreatus* NRC 620, u pprovdew grad ta' attivazzjoni ta' madwar 34% u 20%, rispettivament. Madankollu, f'konċentrazzjoni ta' 10 mM, il-joni Ca²⁺ kienu l-aktar inibitur potenti tal-lakkażi, u naqqsu l-attività tal-enzima b'madwar 60%.
L-effett tal-joni tal-metall fuq l-attività tal-lakkażi Pleurotus ostreatus NRC 620. Il-lakkażi ġiet inkubata għal 10 minuti f'buffer tas-sodium phosphate (0.05 M, pH 7.0) li kien fih diversi joni tal-metall f'konċentrazzjonijiet ta' 2.5 mM u 10 mM. Ir-reazzjoni mbagħad inbdiet biż-żieda tas-sottostrat (ABTS), u wara tkejlet l-attività relattiva.
Ir-riżultati tagħna huma konsistenti ma’ dawk ta’ awturi oħra li sabu li Mg²⁺ u Cu²⁺ isaħħu l-attività ta’ *Trametes polyzona* WRF03³. Castaño et al.⁴⁸ sabu li l-lakkażi minn *Xylaria* sp. hija stimulata sa ċertu punt minn joni tar-ram (Cu²⁺). Barra minn hekk, Foroutanfar et al.⁴⁹ u Si et al.⁵⁰ wettqu studji simili fuq lakkażi minn *Paraconiothyrium variabile* u *Trametes pubescens*, rispettivament. Is-sit ta’ rbit tar-ram tat-tip II (T2) ta’ dan l-enzima jista’ jkun saturat b’Cu²⁺ f’konċentrazzjoni partikolari, li jista’ jispjega l-istimulazzjoni tal-attività tal-lakkażi f’konċentrazzjonijiet ogħla ta’ Cu²⁺³⁹. Peress li l-lakkasi tal-fungi tat-taħsir abjad huma ossidasi li fihom diversi atomi tar-ram, l-effetti tal-joni tar-ram fuq l-attività tal-lakkasi huma diversi u jvarjaw minn stimulanti u inibitorji għal newtrali.⁵¹ B'kuntrast, Zhou et al.^[52]irrapporta li^Cu²⁺inibixxa l-attività tal-lakkażi tat-termite taħt l-art tat-Tajwan (Odontotermes formosanus). Madankollu, il-lakkażi ta' Cerena sp. HYB07^[53]u l-Clitocybe maxima^[54]ma ġewx affettwati minn joni tar-ram.
L-ispeċifiċità tas-sottostrat kienet rappreżentata mill-parametri kinetiċi tiegħu (Km u Vmax); iktar ma tkun qawwija l-affinità ta' rbit tas-sottostrat mal-enzima, iktar ikun baxx il-valur tal-Km u iktar tkun għolja l-ispeċifiċità tas-sottostrat.^3,21,55Il-parametri kinetiċi (Km u Vmax) tal-lakkażi minn *Pleurotus ostreatus* NRC 620 ġew determinati bl-użu tas-softwer GraphPad Prism 6.0 billi ġie pplottjat il-plott Lineweaver-Burk (Figura 5). Meta ntuża ABTS bħala sottostrat, ir-riżultati kienu 1.99 mM u 16217 μmol^{min⁻¹ L⁻¹,}rispettivament. Elsayed et al.²¹irrapporta li l-valuri Km għall-ossidazzjoni tal-ABTS kienu 0.1 mM u 0.064 mM, rispettivament, li jindikaw affinità għolja tal-isoenzimi Lac A u Lac B għall-ABTS. Barra minn hekk, il-valuri Vmax kienu 0.182 μmol^min⁻¹u 0.603 μmol^min⁻¹, rispettivament. Il-valur Km miksub kien inqas minn dak ta' Trametes polyzona WRF03 (8.66 mM); barra minn hekk, il-valur Vmax tagħhom (1429 mmol min⁻¹) kien ukoll^{aktar baxx}meta jintuża ABTS bħala sottostrat.33 Bl-istess mod, il-valuri Km tal-konċentrazzjonijiet tal-lakkażi ta' Lentinus squarrosulus MR13 u Trametes sp. AH28-2 kienu 0.0714 mM u 0.025 mM, rispettivament, u l-valuri Vmax kienu 0.0091 mM min−1 u 0.67 mM min−1 mg−1 (relattivi għall-ABTS)^{, rispettivament.56,57}
L-effett tal-konċentrazzjoni tal-ABTS fuq l-attività tal-lakkażi minn *Pleurotus ostreatus* NRC 620 ġie investigat, u ġie pplottjat plott Lineweaver-Burk tar-reċiproku tal-veloċità tar-reazzjoni inizjali kontra l-konċentrazzjoni tal-ABTS. Ir-reazzjoni ta' ossidazzjoni tal-ABTS b'konċentrazzjonijiet differenti (0.025–3.0 mM) ta' lakkażi ġiet imkejla f'pH 4.5 biex jiġu ddeterminati l-parametri kinetiċi (Vmax u Km). Il-kostanti kinetiċi ta' Michaelis-Menten ġew ikkalkulati bl-użu tal-plott Lineweaver-Burk tar-reċiproku tal-veloċità tar-reazzjoni kontra l-konċentrazzjoni tas-sottostrat. Il-kostanti kinetiċi ġew ikkalkulati mill-plott Lineweaver-Burk bl-użu tas-softwer GraphPad Prism 6.01.
Enżimi tradizzjonali li jiċċaraw, bħall-pektinażi, jidrolizzaw sustanzi pektiċi, u b'hekk inaqqsu l-viskożità u t-turbidità. Huma jkissru b'mod effettiv il-polisakkaridi strutturali u spiss jintużaw flimkien ma' enzimi oħra, bħal ċellulażi u emiċellulażi, biex itejbu r-rendiment u ċ-ċarezza. Madankollu, il-pektinażi ma jimmirawx speċifikament il-komposti fenoliċi, li huma l-kontributuri ewlenin għat-turbidità u l-kannellar ossidattiv, partikolarment f'meraq bħal meraq tat-tuffieħ u tal-għeneb.⁵⁸B'kuntrast, il-lakkasi jikkatalizzaw l-ossidazzjoni tal-komposti fenoliċi, billi jippolimerizzawhom f'molekuli akbar u insolubbli li jistgħu jitneħħew permezz tas-sedimentazzjoni jew il-filtrazzjoni. Dan il-mekkaniżmu mhux biss itejjeb iċ-ċarezza iżda jestendi wkoll il-ħajja fuq l-ixkaffa tal-meraq billi jnaqqas il-probabbiltà ta' kannella ossidattiva kkawżata minn komposti fenoliċi. Barra minn hekk, proċessi ta' kjarifika bbażati fuq il-lakkasi jistgħu jitwettqu taħt kundizzjonijiet ta' pproċessar ħfief (pH 3.5–5.5, temperatura 25–40 °C), u b'hekk ikunu adattati għal meraq delikat mingħajr ma jikkompromettu l-proprjetajiet nutrittivi jew organolettiċi tagħhom.⁵⁹Studji wrew li t-trattament bil-pektinażi jista' jiċċara l-meraq f'1–2 sigħat, filwaqt li t-trattament bil-lakkażi tipikament jeħtieġ ħin ta' reazzjoni itwal (3–6 sigħat) biex inaqqas kompletament il-komposti fenoliċi. Madankollu, dan il-proċess jista' jiġi ottimizzat billi l-enzima tiġi immobilizzata jew billi l-lakkażi tiġi kkombinata ma' metodi ta' kjarifika mekkanika.⁶⁰F'dan l-istudju, il-profiling tal-enzimi tal-estratt mhux raffinat żvela attivitajiet sinifikanti ta' laccase u α-amylase, filwaqt li l-attivitajiet ta' pectinase u xylanase kienu estremament baxxi, u l-attività taċ-ċellulase ma nstabet l-ebda attività. Għalhekk, it-tnaqqis fit-turbidità u l-kontenut fenoliku kien prinċipalment dovut għall-azzjoni tal-laccase, filwaqt li l-bidla fil-viskożità tista' tkun parzjalment dovuta għall-azzjoni tal-amylase.
It-Tabella 1 turi l-parametri fiżikokimiċi tal-meraq tat-tuffieħ frisk u l-kampjuni ttrattati bil-lakkażi. Ir-riżultati wrew li r-rendiment tal-meraq tat-tuffieħ frisk (71.59%) kien inqas minn dak tal-kampjuni ttrattati bil-lakkażi (87.34%). Dawn ir-riżultati huma konsistenti mas-sejbiet ta' Pilnik u Orange.⁶¹, li indika li l-użu ta' enzimi fl-ipproċessar tal-frott jista' jżid ir-rendiment tal-meraq, itejjeb il-filtrazzjoni, u jikseb meraq ċar ta' kwalità għolja għall-konċentrazzjoni. Iż-żieda fir-rendiment tal-meraq hija prinċipalment dovuta għaż-żieda fil-kontenut ta' zokkor solubbli fil-meraq. Matul l-idroliżi enżimatika tal-frott, il-mesoglea u l-pektin fil-ħitan taċ-ċelluli tal-prodott jinqerdu u jiġu konvertiti f'sustanzi solubbli bħal zokkor u aċidi newtrali.^62.Il-valur tal-pH tal-meraq tat-tuffieħ ittrattat bl-enzima kien sinifikament aktar baxx minn dak tal-grupp ta' kontroll (P < 0.05), u l-valur tal-pH taż-żewġ gruppi żdied b'mod sinifikanti waqt il-ħażna (Tabella 1). Dawn ir-riżultati huma konsistenti ma' dawk ta' Mark et al.⁶³, li nnotaw li l-pH tal-meraq tal-frott tal-anakardju naqas wara l-ħażna wara t-trattament bis-sħana. Id-degradazzjoni tal-pektin u l-formazzjoni tal-aċidu galatturoniku wara t-trattament bl-enżimi jistgħu jkunu responsabbli għaż-żieda fil-pH waqt il-ħażna. Il-pH tal-kampjuni ttrattati bl-enżimi baqa' bejn 4.05 u 4.31 matul il-ħażna, filwaqt li l-pH tal-meraq tat-tuffieħ mhux trattat varja bejn 4.12 u 4.33.
L-aċidità totali (TA) kemm tal-kampjuni mhux ittrattati kif ukoll ta’ dawk ittrattati bil-lakkażi wriet xejra ta’ tnaqqis maż-żieda fil-ħin tal-ħażna (Tabella 1). It-tnaqqis fl-aċidità kien attribwit għall-konverżjoni ta’ aċidi organiċi għal karboidrati jew reazzjonijiet enżimatiċi, kif ukoll għall-ossidazzjoni waqt il-ħażna tal-meraq.⁶⁴L-aċidità totali tal-meraq tat-tuffieħ ta' kontroll u l-kampjuni ttrattati bl-enzimi kienet aktar baxxa minn dik ta' meraq ieħor (meraq tal-frawli 0.9%, meraq tal-għanbaqar 2.2%, meraq tal-kumquat 1.0%, meraq tal-berquq 2.4%, meraq tal-larinġ 0.8%), iżda simili għal dik ta' meraq ieħor (eż., meraq tal-lanġas 0.3%).⁶²Dawn id-differenzi fil-meraq tat-tuffieħ frisk mhux trattat jistgħu jkunu dovuti għal diversi fatturi bħal kundizzjonijiet tat-tkabbir, fatturi ġenetiċi, livell ta' maturità, u metodi ta' pproċessar.⁶⁵It-tnaqqis fl-aċidità totali tal-meraq tat-tuffieħ ta' kontroll u dak ittrattat bil-lakkażi huwa konsistenti mar-riżultati ppreżentati minn Singh et al.⁶⁶rigward it-tnaqqis fl-aċidità totali tal-meraq tat-tuffieħ Jin Nuo wara 74 jum ta’ ħażna. Min-naħa l-oħra, Oshmiansky u Wojdylo⁶⁷ma sabux bidliet sinifikanti fl-aċidità tal-meraq tat-tuffieħ meta studjaw l-effett tal-metodi tradizzjonali ta' kjarifika.
Ir-riżultati ppreżentati fit-Tabella 1 jindikaw li l-valur tas-solidi totali solubbli (TSS) tal-meraq tat-tuffieħ ittrattat bil-lakkażi kien ogħla minn dak tal-kampjun mhux trattat. Dawn ir-riżultati huma konsistenti mal-istudji ppubblikati.^{. 68}Barra minn hekk, it-Tabella 1 turi li l-valur tat-TSS tal-grupp ta’ kontroll tal-meraq tat-tuffieħ kien ta’ 9.58 fil-punt tal-ħin inizjali u laħaq il-11.05 sa tmiem il-perjodu tal-ħażna. Dawn il-valuri huma aktar baxxi mill-valuri tat-TSS tal-meraq tat-tuffieħ frisk irrappurtati minn Hamid et al.^{. 69}(11.2 u 11.80, rispettivament). Il-valur tat-TSS tal-kampjuni tal-meraq tat-tuffieħ ittrattati bil-lakkażi żdied b'mod sinifikanti, u beda minn 11.23 u laħaq 12.93 wara ġimagħtejn ta' ħażna f'4°C (Tabella 1). Żieda simili fit-TSS matul il-ħażna ġiet osservata wkoll fil-frott taċ-ċitru, il-lumi, u l-larinġ ħelu. Iż-żieda fis-solidi totali solubbli (TSS) matul il-ħażna tista' tkun dovuta għall-idroliżi tal-polisakkaridi (lamtu) għal monosakkaridi (zokkor), iż-żieda fil-konċentrazzjoni minħabba d-deidrazzjoni tal-meraq, u d-degradazzjoni tal-pektin fil-meraq għal solidi solubbli. Iż-żieda fis-solidi totali solubbli (TSS) x'aktarx hija dovuta għaż-żieda fiz-zokkor solubbli, li jistgħu jiġu ffurmati mill-konverżjoni tal-pektin jew taċ-ċelluloża għal zokkor solubbli permezz tal-pektin jew taċ-ċelluloża, rispettivament, jew mill-idroliżi tal-lamtu għal zokkor, kif irrappurtat minn Hamed et al.^69.L-effett tal-lakkażi fuq il-proprjetajiet tal-meraq tat-tuffieħ jista' jiġi osservat viżwalment, billi l-meraq tat-tuffieħ trattat bil-lakkażi juri fluss aħjar u viskożità aktar baxxa mill-meraq mhux trattat. Din l-osservazzjoni hija rreġistrata fit-Tabella 1; Il-viskożità tal-kampjun trattat bl-enzima kienet ta' 1.87 cP, filwaqt li l-viskożità tal-kampjun ta' kontroll kienet ta' 2.95 cP. Dan it-tnaqqis sinifikanti fil-viskożità x'aktarx huwa dovut għall-kapaċità ogħla taż-żamma tal-ilma ta' sustanzi simili għall-pektin u l-formazzjoni ta' struttura ta' netwerk koeżiv.
F'dan l-istudju, l-effett tal-lakkażi fuq l-indiċi tal-kannellar (BI) tal-meraq tat-tuffieħ ġie investigat billi tkejjel l-assorbenza f'420 nm bl-użu ta' spettrofotometru. Ir-riżultati huma murija fit-Tabella 1. Waqt il-ħażna, il-BI tal-kampjuni tal-meraq tat-tuffieħ kemm fil-grupp ittrattat kif ukoll f'dak mhux ittrattat wera xejra ta' żieda gradwali. Il-BI jirrifletti l-grad ta' kannellar u jista' jservi bħala^importantiindikatur ta' reazzjonijiet ta' kannella enżimatiċi u mhux enżimatiċi. L-assorbenza żdiedet b'mod sinifikanti waqt il-ħażna (P < 0.05). Fi tmiem il-ħażna, l-_A420Il-valur tal-kampjuni tal-meraq tat-tuffieħ fil-gruppi ta’ kontroll u dawk ittrattati bl-enżimi żdied b’madwar 217% u 121%, rispettivament (Tabella 1). Ir-riżultati jindikaw li t-trattament bl-enżimi jista’ jnaqqas b’mod effettiv il-grad ta’ kannella b’madwar 56%. Ir-riżultati ta’ Bezerra et al.^[19]] huma konsistenti mar-riżultati tagħna; Huma użaw fibra tal-laccase-glutaraldehyde-coconut biex jiċċaraw il-meraq tat-tuffieħ, u b'hekk naqqsu l-kulur oriġinali tiegħu b'61%.
Għalkemm il-polifenoli fil-meraq tal-frott għandhom effetti nutrittivi u terapewtiċi pożittivi fuq il-ġisem tal-bniedem, jistgħu wkoll jirreaġixxu mal-proteini, u jikkawżaw li l-meraq isir imdardar, sedimentazzjoni, jew turbidità, u b'hekk ibiddlu t-togħma u l-aroma tal-prodott u jnaqqsu l-ħajja fuq l-ixkaffa tiegħu.⁷¹L-għan ta’ dan l-istudju kien li jitnaqqas b’mod sikur il-kontenut tal-kompost fenoliku tal-meraq tat-tuffieħ bl-użu tal-lakkażi minn Pleurotus ostreatus NRC 620. Ir-riżultati ppreżentati fit-Tabella 1 juru li l-kontenut totali tal-kompost fenoliku tal-meraq tat-tuffieħ ittrattat bil-lakkażi tnaqqas b’mod sinifikanti qabel il-ħażna f’4 °C. Barra minn hekk, il-kontenut totali tal-kompost fenoliku naqas ukoll waqt il-ħażna fiż-żewġ kampjuni studjati (Tabella 1). Riċerka minn Sandri et al.⁷²wera li l-meraq tat-tuffieħ ittrattat bl-enzimi jista' jżomm l-attività antiossidanti u l-kontenut tal-kompost fenoliku tiegħu. Madankollu, ir-riżultati ta' studju minn Lettera et al.⁷³juru li t-trattament tal-meraq tal-larinġ bil-lakkażi fungali jista' jnaqqas il-kontenut ta' komposti fenoliċi fih sa 45%.
Intwera li l-komposti fenoliċi għandhom proprjetajiet bħat-tneħħija tar-radikali ħielsa, it-tnaqqis u t-tifi tal-ossiġnu singlet, it-trasferiment tal-atomi tal-idroġenu, u d-donazzjoni tal-elettroni lil radikali ħielsa, li jagħmluhom antiossidanti potenti.⁷⁴Għalhekk, f'dan l-istudju, intużaw metodi bbażati fuq DPPH u FRAP biex jiġi evalwat l-effett tal-lakkażi fuq l-attività antiossidanti tal-meraq tat-tuffieħ maħżun fi friġġ għal 14-il jum (Tabella 2). Iż-żewġ metodi wrew żieda fl-attività antiossidanti waqt il-ħażna, li tista' tkun dovuta għaż-żieda fil-komposti fenoliċi ħielsa jew il-formazzjoni ta' prodotti tar-reazzjoni ta' Maillard (MRPs), bil-prodotti tar-reazzjoni ta' Maillard x'aktarx ikunu l-kawża taż-żieda fl-attività antiossidanti.⁷⁵Reazzjonijiet ta' kannella mhux enżimatiċi (inklużi d-degradazzjoni tal-aċidu askorbiku, reazzjonijiet ta' Maillard, u degradazzjoni taz-zokkor katalizzata mill-aċidu) jipproduċu pigmenti kannella (melanojdini). Prodotti intermedji ta' degradazzjoni tal-aċidu askorbiku u prodotti ta' degradazzjoni taz-zokkor (bħal komposti karbonili) jistgħu jirreaġixxu mal-aċidi amminiċi permezz ta' reazzjonijiet ta' Maillard.⁷⁶Għalkemm il-kannellar tal-frott u l-ħaxix waqt il-ħażna ġie studjat b'mod estensiv, il-fehim tagħna ta' dawn ir-reazzjonijiet għadu limitat.⁷⁷Meta mqabbel mal-metodu FRAP, il-meraq tat-tuffieħ ittrattat bil-lakkażi wera attività antiossidanti sinifikament aktar baxxa bil-metodu DPPH (Tabella 2), u l-attività antiossidanti tal-kampjuni kollha żdiedet b'mod sinifikanti maż-żieda fil-ħin tal-ħażna. F'dan l-istudju ntużaw żewġ metodi differenti biex tiġi ddeterminata l-attività antiossidanti għaliex il-prinċipji tagħhom huma differenti. Il-metodu DPPH ikejjel il-kapaċità li jinnewtralizzaw ir-radikali ħielsa, filwaqt li l-metodu FRAP ikejjel il-kapaċità li jitnaqqsu l-joni tal-ħadid. Għalhekk, huwa rakkomandat li jintużaw metodi multipli biex tiġi ddeterminata l-attività antiossidanti biex tinftiehem aħjar l-attività antiossidanti tal-kampjuni studjati.⁷⁸
Waħda mis-sejbiet ewlenin ta’ dan l-istudju hija li l-lakkase *Pleurotus ostreatus* NRC 620 turi attività ottimali f’70°C u pH 3.0. Meta mqabbla ma’ lakkasi fungali oħra li jintużaw komunement għall-kjarifika tal-meraq, bħal-lakkasi *Trametes versicolor* u *Ganoderma lucidum*, *P. ostreatus* NRC 620 turi stabbiltà termali ogħla u pH aktar aċiduż. Lakkasi minn *Trametes versicolor* u *Ganoderma lucidum* tipikament juru attività ottimali fil-medda ta’ 50-60°C u f’valuri ta’ pH bejn 3.5 u 5.0. Din id-differenza tista’ tikkontribwixxi għal effiċjenza mtejba tal-kjarifika tal-meraq, speċjalment għal meraq aċiduż fejn l-istabbiltà f’valuri ta’ pH aktar baxxi hija kritika. Il-karatteristika unika ta’ *P. Meta mqabbla ma’ lakkasi fungali oħra studjati, *Pleurotus ostreatus* NRC 620 turi l-abbiltà li tiffunzjona b’mod effettiv taħt kundizzjonijiet aktar diffiċli. It-temperatura ta' attività ottimali ogħla tagħha tissuġġerixxi vantaġġi potenzjali f'applikazzjonijiet industrijali, bħal rati ta' reazzjoni aktar mgħaġġla u kontaminazzjoni mikrobjali mnaqqsa. Il-pH baxx tagħha, li huwa adattat sew għan-natura aċiduża ta' ħafna meraq, jista' jkun utli fil-proċessi ta' kjarifika tal-meraq. Dawn ir-riżultati jiġġustifikaw aktar esplorazzjoni għal applikazzjoni fuq skala kbira, u jagħmlu *Pleurotus ostreatus* NRC 620 alternattiva vijabbli għas-sorsi tradizzjonali tal-lakkażi fungali. Meta mqabbel ma' studji preċedenti, sibna li t-temperatura ottimali hija 60°C u l-pH ottimali huwa 3.0. Wara reazzjoni f'60°C għal 80 minuta, il-lakkażi *Ganoderma lucidum* żammet...⁴⁶% tal-attività tagħha.79 Skont Kurniawati u Nicelle⁸⁰L-enżimi *Ganoderma lucidum* juru stabbiltà eċċellenti sa moderata f'25°C u valuri ta' pH li jvarjaw minn 5.0 sa 8.0, u stabbiltà f'pH 6.0 u temperaturi li jvarjaw minn 10 sa 30°C. F'dan l-istudju, sibna li l-pH u t-temperatura ottimali għall-attività tal-enżimi għal *Pleurotus ostreatus* kienu 3.0 u 70°C, rispettivament. Wara inkubazzjoni f'40°C u 50°C għal sagħtejn, l-enżima żammet 68.33% u 59.61% tal-attività tagħha, rispettivament. Barra minn hekk, il-lakkażi Pleurotus ostreatus NRC 620 wriet attività għolja fuq firxa wiesgħa ta' temperaturi minn 50°C sa 80°C, kważi laħqet l-attività massima (69%–98%), bl-attività massima osservata f'70°C.
Bħala konklużjoni, il-lakkażi tal-faqqiegħ oyster NRC620, miksuba taħt kundizzjonijiet statiċi, uriet attività u stabbiltà ottimali f'firxa ta' kundizzjonijiet ta' pH u temperatura, u wriet stabbiltà superjuri meta mqabbla ma' sorsi oħra ta' enzimi. Iż-żieda ta' 10 mM MgSO₄ u CuSO₄ żiedet l-attività tal-enzima b'madwar 21% u 35%, rispettivament. Meta pproċessata f'meraq tat-tuffieħ, l-enzima naqqset il-pH u l-viskożità, filwaqt li l-kontenut fenoliku naqas biss ftit waqt il-ħażna.
Ir-riżultati jikkonfermaw il-potenzjal tal-lakkażi fl-industrija tal-ikel, partikolarment fil-kjarifika tax-xorb. Billi tkisser speċifikament il-komposti fenoliċi, il-lakkażi mhux biss tnaqqas it-turbidità u ttejjeb iċ-ċarezza iżda żżomm ukoll il-kwalità tal-meraq tal-frott taħt kundizzjonijiet ħfief ta' tħaddim. B'differenza minn aġenti tradizzjonali li jiċċaraw bħall-ġelatina, il-bentonite, u l-ġel tas-silika, il-lakkażi ma tiġġenerax skart jew tneħħi aromi pjaċevoli mix-xorb, u b'hekk hija għażla aktar favur l-ambjent u sostenibbli. Barra minn hekk, meta mqabbla ma' enzimi u metodi ta' filtrazzjoni oħra, il-lakkażi toffri soluzzjoni mmirata u kosteffettiva mingħajr ma tikkomprometti l-kwalità tal-prodott.
Kyomuhimbo, HD u Brink, HG. Applikazzjonijiet u strateġiji ta' immobilizzazzjoni ta' lakkasi li fihom ir-ram; reviżjoni. Heliyon 9, e13156 (2023).